用于活細胞分析的?Incucyte? EV 攝取分析
外泌體和細胞外囊泡 (EV) 均為小膜結合囊泡，通過在細胞之間傳輸脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)，在細胞間通訊中起到關鍵作用。不僅在細胞信號傳導、疾病發(fā)展和治療用途遞送方面發(fā)揮出備受矚目的關鍵作用，并且已經(jīng)證實與癌癥、神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病的基本分子機制相關。研究表明，EV 可以將蛋白質(zhì)、核酸和其他分子從親本細胞運輸?shù)狡渌毎?，有望作為診療工具發(fā)揮強大實力（例如生物標志物或工程化治療用途遞送產(chǎn)品）。
外泌體和 EV 已經(jīng)在諸多細胞生物學細分研究領域展現(xiàn)出不容小覷的生物學作用，因此迫切需要開發(fā)出可靠的分析方法，用于評估此類囊泡被活細胞的攝取情況。一直以來，傳統(tǒng)的 EV 標記方法在追蹤細胞內(nèi)攝取情況方面都存在以下痛點：
- 方案繁瑣，導致 EV 的丟失和功能受損
- 終點分析測量局限于單個時間點
- 存在污染或細胞健康干擾風險，活細胞分析尚待優(yōu)化
- 無差別標記細胞會降低 EV 攝取的動力學測量可靠性
The Incucyte??Exofluor 綠色 EV 標記試劑盒經(jīng)過優(yōu)化，可與 Incucyte? 活細胞成像分析系統(tǒng)配合使用，能夠?qū)崟r測量同一細胞群內(nèi)細胞內(nèi) EV 的攝取，從而監(jiān)測其生物功能。 ?研究人員可以借助該試劑盒獲得有關 EV 攝取機制的寶貴見解，更好地推動未來療法的發(fā)展。
EV 攝取分析解決方案
Incucyte? EV 攝取分析概述
Incucyte? Exofluor 綠色 EV 標記試劑盒可對細胞 EV 攝取實現(xiàn)無擾動、實時、動態(tài)評估，并經(jīng)過驗證可與配置有綠色/紅色或綠色/橙色/NIR 光學模塊的 Incucyte? 活細胞成像分析系統(tǒng)配合使用。Incucyte? Exofluor 綠色 EV 標記染料通過與蛋白質(zhì)和氨基酸共價結合，均勻地標記小型 EV（例如外泌體）的質(zhì)膜。與 EV 不可逆結合并且可去除游離染料，雙管齊下地降低了攝取前或攝取期間染料非特異地附著到其他質(zhì)膜上的風險。
Incucyte? Cell-by-Cell 分析軟件模塊
The Incucyte? Cell-by-Cell 分析軟件模塊可支持一系列貼壁和非貼壁細胞的混合培養(yǎng)應用。可以對貼壁和非貼壁細胞進行非標記細胞計數(shù)，隨后可按照形狀、大小或熒光強度對細胞進行逐個分類，定量分析混合培養(yǎng)中細胞亞群的動態(tài)變化，開啟全新的探索世界。
產(chǎn)品目錄號 9600-0031
利用 Incucyte? 活細胞成像分析系統(tǒng)進行 EV 攝取分析
Incucyte? 活細胞成像分析系統(tǒng)是研究人員在外泌體和 EV 研究中的得力工具。具備實時圖像采集和分析功能，外加 EV 攝取分析功能，深入剖析細胞的動態(tài)變化。實現(xiàn) EV 攝取數(shù)據(jù)與細胞形態(tài)、功能和健康測量結果的結合，可通過單個孔洞悉不同處理或培養(yǎng)條件對于 EV 攝取的影響。Incucyte? 活細胞成像分析系統(tǒng)及其集成式軟件、Incucyte? Exofluor 綠色 EV 標記試劑盒共同組成了一套全面的方法，對于研究活細胞中的外泌體和 EV 具有很好的幫助。
? ?
Incucyte? EV 攝取分析的關鍵優(yōu)勢
在細胞群水平上，觀察并評價細胞內(nèi) EV 攝取變化或宿主細胞內(nèi)的形態(tài)變化
均勻標記來自不同提取方法和不同源細胞的 EV
請參閱下面的示例數(shù)據(jù)
? ?
易于遵循的分析設置，可保留 EV 并消除聚集和游離染料
支持 EV 的功能性攝取分析，可通過均勻標記進行動力學測量或下游分析
請參閱下面的示例數(shù)據(jù)
? ?
Example Data for EV Uptake Assay
收集可靠的 EV 攝取動力學測量數(shù)據(jù)
圖 1. 攝取細胞兼容性：使用 Incucyte? Exofluor 染料標記 A549 外泌體（每孔 2 μg，HansaBioMed）。已標記外泌體的攝取可以在各種細胞類型和培養(yǎng)基條件下實現(xiàn)可視化（上圖）。每種條件下的僅染料對照孔表明，熒光信號不是由于殘留的游離染料造成的（下圖）。使用已標記的 A549 衍生外泌體處理各種細胞類型 24 小時后拍攝的圖像顯示，與對照相比，細胞形態(tài)沒有變化。
適用于各種來源的 EV
圖 2. EV 標記兼容性：圖像顯示 Incucyte? Exofluor 綠色染料標記的各種 EV 經(jīng) A549 受體細胞攝?。ㄌ幚砗?24 小時）。 ?A549 外泌體通過超濾和 SEC 方法提取 (HansaBioMed)，并在 2 μg/孔的條件下進行處理。 ?人血漿來源外泌體（Abcam，超濾萃取法）的使用濃度為 4 μg/孔。 ?MSC 和 HEK293T EV（賽多利斯）均通過 TFF/IEX 色譜法提取，處理濃度分別為 1.5 x 108 和 8.3 x 107 顆粒/孔。
通過簡單的方案保留 EV 及其生物功能
圖 3. Incucyte? Exofluor 綠色 EV 標記試劑盒分析設置的快速指南。試劑盒內(nèi)容物有用于去除游離染料的 Vivaspin? 色譜柱，用于在 Incucyte? 活細胞成像分析系統(tǒng)內(nèi)成像之前滅菌和去除聚集體的 Minisart? 過濾器。
評估 EV 攝取在化合物存在下的動態(tài)變化
圖 4. EV 濃度依賴性：在通過離子交換色譜（賽多利斯）從 HEK293T 細胞中純化 EV 之后，使用 Incucyte? Exofluor 綠色 EV 標記試劑盒標記，并添加到 A549 攝取細胞中。在 2 天內(nèi)每 2 小時采集一次相位和綠色熒光圖像，并使用 Incucyte? Cell-by-Cell 軟件分析。(A) 將已標記的 EV 滴定約 40 倍（4.2 x 108 至 1 x 107 顆粒/孔），并使用平均綠色熒光均值強度評估攝取情況。觀察到相應的濃度依賴性熒光變化。 ?(B) Phase Object Count（相差成像物象計數(shù)）（標準化為 t=0）數(shù)據(jù)表明在所有測試的 EV 濃度下增殖沒有變化。
圖 5. EV 攝取由內(nèi)吞作用決定：將 A549 細胞接種過夜，然后在不含外泌體的培養(yǎng)基中用內(nèi)吞作用抑制劑 Dynasore（0.01 至 100 μM）處理。 ?Dynasore 處理后，立即添加用 Incucyte? Exofluor 綠色染料（2 μg/孔）標記的 Hansa A549 外泌體。 ?外泌體攝取的濃度依賴性抑制 (IC50 = 2.72 μM) 反映在綠色熒光強度上（顯示 24 小時數(shù)據(jù)）。
EV 攝取分析技術資源
相關應用
相關產(chǎn)品
| Product Details | Item Number | List Price | |
|---|---|---|---|
| 加載中 | |||
EV 攝取的常見問答
經(jīng)過驗證表明，Incucyte? Exofluor 綠色 EV 標記試劑盒支持多種 EV 分離方法（包括沉淀、超濾、TFF/離子交換色譜和超速離心）。
每個濃縮管或過濾器最多可處理 40 μg 蛋白質(zhì)或 100 μL 標記的外泌體樣品。蛋白質(zhì)負載量或樣品體積過高可能會導致過濾膜堵塞，標記外泌體樣品超過 100 μL 將導致背景熒光增加。
我們建議使用 1-4 μg 蛋白質(zhì)/孔或 5 x 107 - 1 x 109 顆粒/孔范圍內(nèi)的外泌體。
Incucyte? Exofluor 綠色 EV 標記試劑盒不包含 EV/外泌體，僅包含標記染料、Vivaspin? 2 和 Minisart? 過濾器。所有 EV/外泌體和其他消耗品必須由客戶提供。
我們的分析試劑盒經(jīng)過優(yōu)化和專門設計，可與試劑盒中提供的 Vivaspin?2 濃縮管和/或 Minisart? 過濾器一起使用，與其他耗材混用可能導致信號強度偏差和干擾風險。如有濃縮管或過濾器需求，請向賽多利斯訂購（產(chǎn)品指南中提供的產(chǎn)品目錄號可能因包裝尺寸而異）。
Incucyte? EV 攝取分析應在含有去外泌體血清 (-eFBS) 的分析培養(yǎng)基中進行，以盡可能減少可能影響攝取動力學的內(nèi)源性外泌體。
雖然 EV 分為三個子類，但本試劑盒僅針對外泌體顆粒進行了驗證。 ?我們尚未測試微囊泡或凋亡小體的標記情況。
我們強烈建議使用 Cell-By-Cell 分析。然而，您也可以使用 Basic Analyzer，但可能需要更多優(yōu)化。請參閱產(chǎn)品指南了解更多詳情。
出于綠色熒光信號的原因，Incucyte? Exofluor 綠色 EV 標記試劑盒適用于 Incucyte? SX5、S3 或 SX1 活細胞成像分析系統(tǒng)。
